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银杏蛋白-海藻酸钠制备包埋植物乳杆菌微胶囊及其性能研究

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行业新闻
2019/10/28 11:52

  益生菌是一类可通过改善肠道菌群而对动物产生有利影响的活性微生物添加剂,益生菌在人体肠道内的存活和增殖对其发挥保健功效起到决定性作用。

  植物乳杆菌

  植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是乳酸菌的一种,具有调节肠道微生态、降低血清胆固醇水平以及降低心血管疾病发病率等功效,植物乳杆菌独特的营养和保健功能在食品工业中有着广泛的应用前景。

  但益生菌活菌期的时间比较短,在加工过程和贮藏期间保证其存活率和生物活性是益生菌产品面临的重大挑战。

  微胶囊化

  微胶囊化是一种能高效保持益生菌活力的方法,已在长双歧杆菌(Bifibobacterium longum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)等菌种中被广泛应用。为了提高益生菌的有效运载,微胶囊壁材的选择成为首要关注的问题。

  蛋白质

  蛋白质因其具有良好的生物降解性及生物相容性等特性,在益生菌活性保护与运载方面显示出良好的应用潜质。

  银杏干果中含有14%左右的蛋白,银杏蛋白具有较好的乳化性、乳化稳定性和黏度,因此可以作为益生菌包埋的壁材。

  然而,迄今为止银杏蛋白作为包埋壁材的研究尚未见相关报道。

  南京林业大学徐鹏翔,吴彩娥等以银杏蛋白和海藻酸钠为壁材包埋植物乳杆菌,研究银杏蛋白微胶囊的制备工艺,并对其在胃肠道释放性能和贮藏稳定性进行评价,以期为银杏蛋白在益生菌微胶囊的开发利用提供理论依据。

  一、材料与方法

  1.1 材料与试剂

  1.2 仪器与设备

  1.3 实验方法

  1.3.1 银杏蛋白提取

  1.3.2 植物乳杆菌培养及菌悬液的制备

  1.3.3 植物乳杆菌微胶囊的制备

  1.3.4 微胶囊活菌包埋率测定

  1.4 试验设计

  1.4.1 单因素试验

  1.4.2 正交试验

  1.4.3 植物乳杆菌微胶囊性能评价

  1.5 数据处理

  二、结果与分析

  2.1 影响植物乳杆菌微胶囊活菌包埋率的主要因素

  2.1.1 壁材质量浓度

  壁材质量浓度对植物乳杆菌微胶囊活菌包埋率的影响如图1所示。随着壁材质量分数由1.0%增加到3.5%,植物乳杆菌微胶囊活菌包埋率呈先增加后降低的趋势;当壁材质量分数为2.0%时,植物乳杆菌微胶囊的活菌包埋率达到61.78%,显著高于其他4个分数下的活菌包埋率。本研究中选用的壁材为银杏蛋白⁃海藻酸钠复合壁材,当壁材质量分数较低时,体系黏合力小,不容易形成微胶囊,从而导致低活菌包埋率;当壁材质量浓度过高时,体系黏合力大,采用挤压法很难形成微胶囊,也会造成活菌包埋率低的问题。杨剀舟等采用海藻酸钠、乳清蛋白以及VE为壁材,采用挤压法制备长双歧杆菌微胶囊,包埋率均在95%以上。王远一飞等以壳聚糖-黄原胶复合材料为壁材,采用乳化包埋法制备鼠李糖乳杆菌微胶囊,当壳聚糖质量分数为0.8%、黄原胶质量分数为1.0%时,包埋率仅为16%~19%。本研究结果中植物乳杆菌包埋率介于两者之间,可能是由于包埋方法和壁材不同造成的。

  2.1.2 菌液与壁材比例

  菌液与壁材比例对微胶囊活菌包埋率的影响如图2所示,菌液与壁材体积比为1∶2时植物乳杆菌的活菌包埋率最高,随着壁材占比增大,活菌包埋率逐渐减小。这是因为在一定范围内,壁材浓度相对较小,竞争不激烈,菌液较易被包埋;当壁材占比过量时,壁材分子间作用力增大,碰撞激烈,溶液黏度增大且孔隙基本饱和,极大影响了微胶囊包埋效果,使得活菌包埋率降低。马岩等研究表明以明胶、麦芽糊精和葡萄糖为复合壁材制备益生菌微胶囊时,壁芯比过大或过小均不利于提高包埋率。因此,本试验选择菌液与壁材体积比为1∶2作为最佳比例。

  2.1.3 CaCl2质量浓度

  CaCl2作为固化剂,在微胶囊的形成过程中起着重要的作用,其影响效果如图3所示。随着CaCl2质量浓度的逐渐增加,植物乳杆菌微胶囊活菌包埋率不断增大,当CaCl2质量分数超过4.0%时,活菌包埋率开始下降。这是因为随着CaCl2质量浓度的增加,溶液中银杏蛋白⁃海藻酸钠结合度提高,形成了更为致密的凝胶结构。当CaCl2质量浓度过高时,造成微胶囊的囊壁过厚从而不利于植物乳杆菌的释放,会影响到微胶囊的破壁效果,导致了活菌包埋率的降低。杨剀舟等认为长双歧杆菌微胶囊的制备中,CaCl2质量分数以3.0%为宜,而费国琴等发现溶菌酶微胶囊固化液中CaCl2质量分数以2.0%为宜。笔者选用的CaCl2质量分数为4.0%作为最适宜的固化液浓度。

  2.1.4 固化时间

  固化时间对植物乳杆菌微胶囊活菌包埋率的影响如图4所示,随着固化时间的延长,植物乳杆菌微胶囊活菌包埋率呈先增加后降低的趋势。当固化时间为20min时,植物乳杆菌包埋率显著高于其他固化时间。当固化时间继续延长时,微胶囊的囊壁厚度已经固定,微胶囊活菌包埋率呈下降趋势。现有研究表明,固化时间过长会导致微胶囊中微生物死亡,从而导致活菌包埋率下降。杨剀舟等选择30min作为长双歧杆菌的最佳固化时间,而王欢等对青春双歧杆菌的包埋中选择10min作为固化时间。本研究则选择20min作为最适固化时间。

  2.1.5 微胶囊制备的最佳工艺条件

  在单因素试验的基础上,进行正交试验设计,考察不同壁材质量浓度、菌液与壁材比、CaCl2质量浓度以及固化时间对植物乳杆菌活菌包埋率的影响,正交试验设计如表2所示。从表2可以得到每组3次平行试验所得活菌包埋率的平均值,从而进行正交试验结果的直观分析和方差分析。通过正交试验确定最佳工艺组合,试验结果见表2。由极差分析可知,影响植物乳杆菌微胶囊活菌包埋率的因素主次关系为:A(壁材质量浓度)>D(固化时间)>C(CaCl2质量浓度)>B(菌液与壁材比),最优水平组合为A3B2C3D2,即壁材质量分数为2.5%,菌液与壁材体积比为1∶2,CaCl2质量分数为5%,固化时间为20min。在最优条件下植物乳杆菌包埋率达到86.33%,显著高于正交试验最高组。植物乳杆菌活菌包埋率的平均值为4个因素的综合响应值,结果可由图5所示进行直观分析。通过比较其中4个因素的综合效应来评价各因素中各水平的好坏。由图5可知,较低或较高的壁材质量浓度和氯化钙质量浓度均导致活菌包埋率明显变化,低质量浓度的壁材体系不能形成致密的网络体系实现植物乳杆菌的包埋,而低质量浓度的氯化钙体系不能有效交联海藻酸钠分子造成体系中植物乳杆菌在微胶囊中的流失,从而导致较低的活菌包埋率,而壁材质量浓度的变化对活菌包埋率的影响更大,表明壁材质量浓度相对氯化钙质量浓度而言,是影响活菌包埋率的重要因素。壁材和氯化钙质量浓度增加到一定范围,活菌包埋率会明显下降,说明其他因素对活菌包埋的影响已经不可忽视。然而,较长的固化时间会影响体系中植物乳杆菌活菌的存活,从而导致活菌包埋率的大幅下降。说明壁材质量浓度、氯化钙质量浓度和固化时间相比,在各因素水平范围内对包埋率有着不同的影响。此外,菌液与壁材比对活菌包埋率影响起伏很小,说明壁材占比不会影响植物乳杆菌在微胶囊中的存活情况,可以认为在本试验中该因素的各水平下对植物乳杆菌的活菌包埋率不会有明显的影响。

  为了研究各因素对活菌包埋率的影响是否显著,对表2数据进行方差分析,结果如表3所示,F值反映其对试验指标的影响大小,由F值可知,4因素对植物乳杆菌微胶囊活菌包埋效果的影响大小顺序为:A>D>C>B,这与正交试验极差分析一致。壁材质量浓度、CaCl2质量浓度和固化时间对植物乳杆菌微胶囊活菌包埋率影响达到显著水平(P<0.05),而菌液壁材比对植物乳杆菌微胶囊活菌包埋率影响不显著。

  2.2 植物乳杆菌微胶囊的性能评价

  2.2.1 微胶囊在模拟胃液中的耐受性

  植物乳杆菌微胶囊在模拟胃液中的耐受性影响见图6。在模拟胃液中,植物乳杆菌微胶囊表面的微生物不断溶出,导致微胶囊中菌落数呈下降趋势,120min后微胶囊中菌落数为5.1lgCFU/g ,这表明制备得到的植物乳杆菌微胶囊在模拟胃液中有一定的耐受能力。现有研究表明,微胶囊的壁材一定程度上可以延长活菌在胃液中的生存时间。在酸性条件下,微胶囊的复合壁材遭到破坏,导致益生菌的靶向释放,在酸性中停留时间越长,微胶囊表面破坏越严重,对包埋的扩散限制作用越差,进而导致微胶囊在模拟胃液中的控释能力降低。因此本研究中的植物乳杆菌微胶囊不适宜在食物消化过程中摄入,应减少其在胃中的提留时间。

  2.2.2 体外模拟微胶囊的肠溶性

  微胶囊能否在人体特定部位溶解并释放对其至关重要,其肠溶性结果如图7所示。由图7可知,模拟肠液中植物乳杆菌菌落数在不断增加,60min后菌落数趋于平缓,这表明由银杏蛋白-海藻酸钠制备得到的微胶囊在60min后解囊完全,具有较好的肠溶性。模拟肠液中的胰酶对银杏蛋白可能存在水解作用,这也会加速微胶囊在模拟肠液中的崩解。寇秋丽等研究发现,副干酪乳杆菌HD1.7微胶囊在人工肠液1.5h后完全崩解,存活率基本稳定在57%,这为其在肠道中发挥进一步的益生功效奠定了基础。

  2.2.3 微胶囊的贮藏稳定性

  温度是影响微胶囊制品贮藏性能的重要因素之一,温度会对壁材的理化性质产生一定影响。植物乳杆菌微胶囊在贮藏期间菌落数呈不断下降的趋势,结果如图8所示。在37℃贮藏条件下,植物乳杆菌微胶囊在0~10d的贮藏期间,菌落数迅速下降,最终趋于零,说明植物乳杆菌已全部失活。在4℃贮藏条件下,植物乳杆菌微胶囊菌落数下降缓慢,经30d贮藏后,菌落数为3.31lgCFU/g。余乐和Maria等研究发现在4℃条件下,可以延缓贮藏过程中植物乳杆菌活菌数目减少的程度,表明植物乳杆菌适宜低温贮藏。这是因为低温导致乳杆菌处于休眠状态,并且壁材可以在一定程度上抵御了外界环境对乳杆菌的不良影响。

  三、结论

  以银杏蛋白、海藻酸钠为壁材,通过挤压法制备植物乳杆菌微胶囊,通过对壁材质量浓度、菌液与壁材体积比、CaCl2质量浓度、固化时间以及微胶囊性能的研究,得出如下结论:

  (1) 在单因素试验的基础上,设计正交试验,发现影响植物乳杆菌微胶囊制备的主次因素依次是:壁材质量浓度、固化时间、CaCl2质量浓度、菌液与壁材比。

  (2) 制备植物乳杆菌微胶囊的最佳工艺条件为:以质量比为1∶1的银杏蛋白和海藻酸钠作为壁材,壁材质量分数为2.5%,菌液与壁材体积比为1∶2,CaCl2质量分数为5%,固化时间为20min。在此最佳条件下制备的微胶囊活菌包埋率可达86.33%。

  (3) 通过模拟胃液耐受性和模拟肠道释放性能试验得出,银杏蛋白-海藻酸钠植物乳杆菌微胶囊在模拟胃液中具有一定的耐受能力,在模拟肠液中60min后完全解囊,表明微胶囊的肠溶性较好。

  (4) 通过4℃ 贮藏试验表明银杏蛋白-海藻酸钠植物乳杆菌微胶囊适宜低温贮藏。笔者利用银杏蛋白这一材料作为微胶囊的新型壁材,确定银杏蛋白和海藻酸钠复合壁材对植物乳杆菌能够起到一定的保护作用,为微胶囊新型壁材的开发提供了原材料,同时也为银杏的综合应用开辟了途径。

  文章来源于《林业工程学报》2019年第5期,版权属原作者所有,如有侵权请联系删除。原创作者:徐鹏翔、吴彩娥、范龚健等。

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